细胞生物学实验教程 pdf mobi txt word epub 下载 2024

　　《细胞生物学实验教程（第二版）》从基础性实验、综合性实验和设计性实验3个层面设置了39个实验项目，旨在培养学生的细胞生物学基本实验技能和综合创新能力。内容涵盖光学显微镜技术、细胞化学技术、细胞器的分离和鉴定技术、染色体标本制作技术、细胞培养和细胞融合技术、染色体畸变检测技术、细胞凋亡检测技术，以及细胞生物学设计性实验的选题、设计和实施等内容。附录部分附有常用试剂的配制、光学显微镜维护、电子显微镜的构造和使用方法、器械清洗方法、常用参数换算及实验报告的写作方法等，以备查阅。

目录

第二版前言

**版前言

**部分 基础性实验

实验1 普通光学显微镜的使用、细胞的形态观察和大小测定 2

实验2 暗场显微镜和相差显微镜的使用 12

实验3 荧光显微镜的使用 18

实验4 细胞器的活体染色 25

实验5 细胞内核酸的原位显示 29

实验6 细胞内蛋白质的定位 32

实验7 细胞内酶的定位 34

实验8 细胞内糖类的显示 38

实验9 细胞内脂类的显示 40

实验10 酶联免疫吸附测定法 42

实验11 细胞活性的鉴定 47

实验12 细胞膜的通透性和巨噬细胞的吞噬活动 50

实验13 细胞凝集反应 54

实验14 果蝇唾腺细胞巨大染色体的观察 56

实验15 细胞的减数分裂 59

第二部分 综合性实验

实验16 常用显微镜制片技术 64

实验17 细胞骨架的光学显微镜观察 73

实验18 动物骨髓细胞染色体标本的制备 79

实验19 人外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备 82

实验20 植物细胞染色体标本的制备 86

实验21 显示染色体核仁组织区的银染色法 88

实验22 荧光原位杂交技术定位端粒序列 91

实验23 细胞器的分离和鉴定 94

实验24 动物细胞培养 98

实验25 细胞增殖能力的检测——集落形成实验 106

实验26 MTT比色法检测细胞存活状态 109

实验27 培养细胞生长状态评价——有丝分裂指数和生长曲线测定 111

实验28 细胞同步化 114

实验29 流式细胞术测定细胞周期 117

实验30 动物细胞融合 120

实验31 植物原生质体的分离、融合和培养 124

实验32 细胞转染技术 128

第三部分 设计性实验

实验33 完整叶绿体的分离、纯化及观察 132

实验34 逆境对植物细胞膜系统的损伤和破坏 136

实验35 植物细胞悬浮培养 138

实验36 单细胞凝胶电泳试验检测细胞DNA损伤 140

实验37 环境有害物质对微核的诱导和检测 144

实验38 细胞凋亡的诱导和检测 147

实验39 植物次生代谢物质对肿瘤细胞增殖的影响 152

第四部分 附录

附录Ⅰ 常用染料简介和常用染色剂配方 156

附录Ⅱ 细胞生物学实验常用缓冲液的配制 165

附录Ⅲ 细胞生物学实验常用培养基的配制 172

附录Ⅳ 常用生物固定液 178

附录Ⅴ 封片剂和粘贴剂 184

附录Ⅵ 光学显微镜的维护 185

附录Ⅶ 电子显微镜技术 187

附录Ⅷ 器械的清洗与消毒 193

附录Ⅸ 实验室常用技术参数 196

附录Ⅹ 常用植物激素、抗生素的配制 202

附录Ⅺ 部分动物、植物及人的染色体数目 203

附录Ⅻ 撰写细胞生物学实验报告的要求 204

参考文献 212

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**部分 基础性实验

　　实验1 普通光学显微镜的使用、细胞的形态观察和大小测定

　　光学显微镜是生物学研究不可缺少的工具，其利用光学成像原理把肉眼观察不到的物体放大几百倍甚至上千倍，使研究者能够对生物体的很多细微结构进行观察和研究，把人们的视觉从宏观引向微观，促成了细胞学和微生物学等学科的创立。普通光学显微镜的构造主要由机械装置、光学部分和光源部分三部分组成(图1.1)。

　　图1.1 显微镜的结构示意图(改自杨继，2000)

　　机械装置是用于光学系统的支承和运动，并通过它调节光学系统的正确位置。机械装置包括以下部分：镜座(base) 是位于**部的构造，为整个显微镜的基座，起稳固作用以支持着整个镜体。大部分光学显微镜的镜座上安装有光源。镜柱上方弯曲的弓形部分叫做镜臂(arm)，一端连于镜柱，一端连于镜筒，是取放显微镜时手握的部位。镜筒(light tube)是物镜与目镜之间的金属筒，为光学通路，上端装载目镜，下端连接物镜转换器。根据镜筒的数目，光镜可分为单筒式和双筒式。单筒光镜又分为直立式和倾斜式两种，镜筒直立式光镜的目镜与物镜的光轴在同一直线上，而镜筒倾斜式光镜的目镜与物镜的中心线互成45°角，在镜筒中装有使光线转折45°的棱镜，现代光学显微镜大多为镜筒倾斜式，双筒式光镜的镜筒均为倾斜式的。从物镜的后缘到镜筒尾端的距离称为机械筒长。物镜的放大率是对一定筒长而言，镜筒长度的变化会导致放大倍率和成像质量发生变化，因此不能随意改变显微镜镜筒长度，国际上将镜筒长度标准定为160mm，此数字标在物镜的外壳上面。物镜转换器(nosepiece) 位于镜筒下端，是一个可以转动的圆盘，一般有2~4个物镜接口用以安装放大倍数不同的物镜。变换物镜可以通过旋转物镜转换器，当旋至物镜和镜筒成直线时，就发出“咔”的响声，方可观察玻片标本。载物台(stage)也称镜台，是位于镜臂下面的平台，用以放置玻片标本。载物台中央有一圆形的通光孔，来自聚光器的光线可以通过它由下向上照到标本上。载物台上一般装有标本推进器(推片器)，由位于载物台的后方和侧面边缘的一横一纵2个推进齿轴金属架构成，金属架杆上刻有标尺，构成了紧密的平面坐标系。如果需要重复观察已经检查标本的某一部分，在**次检查时记下纵横标尺的数值，以后按照数字移动推进器即可找到原来标本的位置。载物台上方或下方一侧有两个旋钮，为推进器调节轮，可使玻片标本做左右、前后方向的移动。标本推进器上有纵横游标尺，用以测定标本在视野中的方位及其大小。游标尺一般由主标尺(A)和副标尺(B)组成。副标尺的分度为主标尺的9/10。使用时，首先看副标尺的0点位置。然后看主、副标尺的一致点。如图1.2所示，副标尺的0点在主标尺的26与27之间，副标尺的6与主标尺的32一致，即6与主标尺上的一个分度线正对， 则此标尺所表示的数值为26.6mm；推进器左侧有弹簧夹， 用以夹持玻片标本。 调焦螺旋(focus adjustment)也称调节器，为调节焦距的装置，分粗调节器(大螺旋) 和细调节器(小螺旋)两种。粗调节器可使镜筒或镜台做较快或较大幅度的升降，能迅速调节好焦距。粗调焦旋钮每旋转一圈可使载物台或镜筒升降10mm，适于低倍镜观察时调焦。细调焦旋钮每旋转一圈可使载物台或镜筒升降0.1mm (100mm)，适用于在低倍镜下用粗调节器找到物体后，在高倍镜和油镜下进行焦距的精细调节，以此对物体不同层次、深度的结构做细致的观察。现代显微镜的粗调焦螺旋和细调焦螺旋多采用共轴式结构，并有锁定装置避免物镜因接触到玻片标本而受损。

　　图1.2 游标尺的用法

　　普通光学显微镜的光学部分包括物镜(objective lens)、目镜(ocular lens)、聚光器(condenser)和滤光片(light filter)等。物镜是装在物镜转换器上的一组镜头，是显微镜*重要的光学部件，它决定了显微镜像的质量、分辨率和放大倍数。由于物镜靠近被观察的物体，故又称为接物镜。按照放大倍数，物镜一般分低倍镜、高倍镜和油镜。通常在物镜上标有主要性能指标——放大倍数和数值孔径(镜口率) (如10/0.25、40/0.65和100/1.30等)、镜筒长度和所要求的盖玻片厚度(如160mm/0.17mm)。随着放大倍数的增加，物镜镜体长度增加(在镜体上刻有数字，低倍镜一般有4×、10×， 高倍镜一般有40×， 油镜一般是90×、100×，×表示放大倍数)。不同倍数物镜的技术参数见表1.1，不同厂家略有差异。用低倍镜和高倍镜时，标本与物镜之间的介质是空气。用油镜时，两者之间的介质必须使用香柏油或液体石蜡， 香柏油的折射率和玻璃的折射率大致相同。 目镜(ocular lens)装在镜筒上端，其功能是将物镜形成的中间像进一步放大，并矫正物镜余下的像差和色差，使之便于观察，但不能提高显微镜的分辨率。目镜通常由2块透镜组成，上端的透镜称为接目镜(eye piece)，下端的透镜称为场镜(field piece)，在接目镜和场镜之间或场镜下端设有金属光阑——视场光阑，以限制视野去掉周边的模糊像，光阑的位置就是物镜所放大的实像位置，可在其上面安装指示针(用以指示要观察的某一部分)或目微尺。目镜上一般刻有放大倍数(如5×，10×)。有些目镜上具有标志，代表了目镜的类型，如补偿目镜(K或C)、摄影目镜(P)、平场目镜(Plan) 等。显微镜对实物总的放大倍数由目镜、物镜和镜筒长度共同决定。镜筒长度一般为160mm (少数为170mm)。物体*后被放大的倍数为目镜放大倍数与物镜放大倍数的乘积，如物镜是40×，目镜是10×，则物体*后放大倍数为40×10=400×；聚光器(condenser)位于载物台下方，是光学显微镜光学系统中一个重要的组成部分，由聚光透镜、孔径光阑和升降螺旋组成。聚光透镜的功能是将从光源射来的光线汇集成束投射到所要观察的标本上，增强视野的亮度，使物像获得清晰明亮的效果；聚光器的高低由升降螺旋调节，往上升时增强反射光，下降时减弱反射光。聚光器有3种类型：阿贝氏聚光镜(常标有Abbe字样)、消色差聚光镜(常标有Aplant字样)和消球差聚光器(常标有Achromat字样)。光束进入聚光镜的大小由可变光阑——孔径光阑(aperture diaphragm)来控制。孔径光阑又称光圈，是在聚光镜底部的一个圆环状结构，装有多片半月形的薄金属片，叠合在中央成圆孔形。在圆环外缘有一突起的小柄，拨动它可使金属片分开或合拢，以改变照明光束的直径，调节进光量，改变视野的明暗和反差，使物像更为清晰；用显微镜观察标本或进行摄影时，往往需要选择某一波段的光线，而排除不需要的光线。滤光片(light filter)起着选择光线的作用，改变从光源射来的各种光线的组成，提高分辨率，增强反差，或在彩色照相时调剂色温。由于短波光分辨率较高，因此通常采用蓝色滤光片；为了观察清楚，减少视觉疲劳，常用互补色，如红青、绿红、蓝黄等；为了减少色差，可用单色光，一般采用绿、黄绿光对眼睛*适宜。

　　表1.1 不同倍数物镜的比较(章静波等，2006)

　　注：表中的工作距离是指显微镜处于工作状态(物像调节清楚)时，物镜的下表面与盖玻片(盖玻片的厚度一般为0.17mm)上表面之间的距离，物镜的放大倍数越大，其工作距离越小

　　普通光学显微镜的光源部分包括光源系统反光镜(mirror) 和显微镜镜灯(lamp)。反光镜是普通光学显微镜的取光设备，是装在载物台下面、镜柱前方的一面可转动的圆镜，它有平凹两面。平面镜聚光力弱，适合光线较强时使用。凹面镜聚光力强，适于光线较弱时使用。转动反光镜，可将光源反射到聚光镜上，再经镜台中央圆孔照明标本。目前许多类型的显微镜都采用人工光源，即内置式灯光照明，不再需要反光镜；显微镜镜灯是一种人工光源，分外光源和内光源。内光源是安装在镜座内的照明装置，光束直接射向聚光镜，或经底座内部的反射装置折入聚光镜。光线的强弱由镜座上的光亮调节旋钮控制。

　　显微镜的放大倍数是物镜的放大倍数与目镜的放大倍数的乘积， 如物镜为10×，目镜为10×，其放大倍数就为10×10=100。

　　细胞是生命活动的基本结构单位和功能单位。多细胞生物体内有不同类型的细胞，其形态、大小差异较大，人和动物细胞直径一般为10~20mm，一般植物细胞的大小为几十微米，很难用肉眼观察，因此，需借助于显微镜才能观察到细胞内部结构。一般光学显微镜**分辨率为0.2mm，细胞内的一些结构如线粒体、质体、高尔基体、中心体、核仁、染色体等都大于0.2mm，能在光镜下观察到，通常把在光镜下所见到的结构称为显微结构(microscopic structure)。

　　细胞大小测量是研究细胞的基本方法之一。在显微镜下测量细胞大小的工具是显微测微尺。显微测微尺由物镜测微尺(stage micrometer，简称物微尺或台微尺)和目镜测微尺(ocular micrometer，简称目微尺) 组成(图1.3)，二者要配合使用。目镜测微尺是一个可以放在目镜内的一直径为2cm 特制圆玻片，其上有50或100等分格的刻度尺。每一小格表示的长度随着不同显微镜、不同放大倍数的物镜而异；物镜测微尺为一特制载玻片，中央贴一圆形盖玻片封固着一具有精细刻度的标尺，标尺长度为1mm，等分为100格，每格长0.01mm (10mm)，标尺的外围有一小黑圈。目微尺测量的是细胞经过物镜放大后的像，因而每格所代表的实际长度随着物镜的放大倍率而变化。因此当测量细胞大小时，需要先用物微尺标定目微尺每一格所代表的实际长度，然后移去物微尺，换上待测标本，再测定细胞大小，而不能用目镜测微尺直接测量细胞。

　　图1.3 目微尺和物微尺的外观形态(辛华，2004)

　　目前，显微互动设备广泛用于细胞生物学实验教学。利用校准片配合显微数码互动系统中的测量软件，不但可以测量细胞的大小，而且可以测量细胞的周长和面积等。该系统中所用的校准片即上述的台微尺。

　　【实验目的】

　　(1) 理解普通光学显微镜的机械系统和光学系统的结构组成及其工作原理，熟练掌握普通光学显微镜的使用方法。

　　(2) 认识光学显微镜下细胞的各种形态结构。

　　(3) 掌握测微尺的基本原理、安装和使用方法。

　　【材料、器材和试剂】

　　材料：人体口腔上皮细胞(epithelialcell)、洋葱(Alliumcepa Linn.)鳞茎。

　　器材：普通光学显微镜、显微测微尺(物镜测微尺和目镜测微尺)、擦镜纸、刀片、载玻片、盖玻片、牙签、吸水纸。

　　试剂：无水乙醇、香柏油、1%碘液、1%甲苯胺蓝。

　　【实验方法和步骤】

　　1. 显微镜的使用

　　1) 显微镜观察前的准备工作

　　使用显微镜前，将显微镜放置在身体左前方的实验台上，镜座应距桌沿10cm左右。先检查显微镜的各个部分是否完整和正常，并对载物台、目镜、物镜和聚光镜进行必要的清洁工作，然后进行必要的调整。

　　对光：用左手转动粗调螺旋使镜筒上升或载物台下降，然后转动物镜转换器使低倍镜对准载物台的通光孔(转动时应注意使物镜上方的缺刻与基座的固定扣相扣合，当转动到听见“咔”声响，或同时亦感到有阻力时立即停止转动，说明物镜已与镜筒成一直线)；拨动聚光器孔径光阑的小柄，使光阑完全打开；旋转聚光器升降螺旋，使聚光器上端透镜平面稍低于载物台平面的高度，转动反光镜，使视野内的光达到完全均匀明亮；自带光源的显微镜，可通过调节电流旋钮调节光照的强弱。

　　调节光轴中心：显微镜工作时，其光学系统中的光源、聚光器、物镜和目镜的光轴及光阑的中心必须与显微镜的光轴同在一直线上。目前多数厂家的显微镜在设计上已经保证了目镜和物镜合轴，只要旋转物镜转换器，将物镜推到工作位置便能使目镜和聚光镜合轴，而不必进行合轴调节。但有些显微镜的聚光镜可以升降和水平移动，就必须调节聚光镜中心对正光轴。具体操作步骤为：先将光

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可作为高等院校生物科学、生物技术专业及农学、林学、医学等相关专业细胞生物学的实验指导用书，相关学科科研人员

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